壳素及其衍生物抑制瘢痕形成：研究与进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：甲壳素及其衍生物抑制瘢痕形成方面的作用及机制成为近年来研究的热点。

目的：综述就近年来甲壳素及其衍生物抑制瘢痕形成的研究进展。

方法：应用计算机检索中国知网、万方数据库、维普数据库及PubMed数据库，检索有关甲壳素抑制瘢痕治疗进展的文献，检索中文关键词为“甲壳素，衍生物，瘢痕形成”，英文关键词为“Chitin; Derivatives; Scar Formation”。

结果与结论：甲壳素及其衍生物能直接或通过改变如生化因子、干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素等各种因子，抑制瘢痕中成纤维细胞的增殖、分化及分泌功能；能改变伤口及瘢痕中免疫细胞的作用；能减少胶原形成，促进胶原降解；促进伤口肉芽血液循环的建立，减轻组织缺氧；促进表皮细胞和内皮细胞的生长，加速伤口愈合；抑制创面细菌繁殖，减轻感染，加速愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 甲壳素, 衍生物, 抑制, 瘢痕形成

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, chitin and its derivatives have become a hotspot because of their action and mechanism of inhibiting scar formation.

OBJECTIVE: To review the research progress in chitin and its derivatives that inhibit scar formation.

METHODS: A computer-based search of CNKI, Wanfang, VIP and PubMed databases was performed for articles related to inhibitory effect of chitin on scar formation. The keywords were “chitin; derivatives; scar formation” in Chinese and English, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: Chitin and its derivatives can inhibit fibroblast proliferation, differentiation and secretion in the scar directly or through altering different factors, such as biochemical factors, interferons, tumor necrosis factor, and interleukin; alter the role of immune cells in the wound and scar; reduce collagen formation and promote collagen degradation; promote the establishment of wound granulation blood circulation, thereby reducing tissue hypoxia; facilitate the growth of epidermal cells and endothelial cells to accelerate wound healing; inhibit wound bacteria, reduce wound infections and accelerate wound healing.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, cicatrix, review

中图分类号:

R318

李天石，曾文妮，何君君. 壳素及其衍生物抑制瘢痕形成：研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8504-8508.

Li Tian-shi, Zeng Wen-ni, He Jun-jun. Chitin and its derivatives inhibit scar formation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(52): 8504-8508.

图/表（结果） 1

2.1 甲壳素及其衍生物对成纤维细胞的影响 张敬德等^[7]用组织块法进行瘢痕疙瘩、增生瘢痕、正常瘢痕成纤维细胞的体外培养；用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测不同浓度甲壳素对不同来源成纤维细胞生长增殖和细胞周期的影响。结果发现随着甲壳素浓度的增高，各组G₀+G₁期的成纤维细胞百分比都上升，S期及G₂+M期的成纤维细胞百分比都下降。夏平元等^[8]利用流式细胞仪及免疫组织化学染色观察几丁糖对人成纤维细胞的增殖周期和细胞核中Ki-67抗原表达的影响，发现几丁糖能显著抑制人成纤维细胞的DNA复制和增殖，且作用呈浓度依赖性。王亚辉等^[9]利用透射电镜观察几丁糖对正常瘢痕及增生瘢痕成纤维细胞形态结构的影响，结果发现随几丁糖浓度增加，两组细胞内胶原、核糖体、高尔基体等减少，线粒体脊低、少，细胞功能明显受抑制，凋亡细胞增加。夏平光等^[10]用含不同浓度甲壳素培养液培养成纤维细胞后，使用流式细胞仪检查细胞凋亡率，发现甲壳素浓度为0.1 1，1.10 g/L时，成纤维细胞的凋亡率分别为(5.83± 1.35)%，(8.94±1.67)%，(26.23%±4.56)%，显著高于空白对照组的(1.53±0.35)%(P < 0.05)，说明甲壳素能促进成纤维细胞的凋亡。

肌成纤维细胞由majno于1971年首先发现报道，随后研究人员对其进行了大量研究，目前认为肌成纤维细胞是瘢痕收缩的主要原因^[11-12]，转化生长因子是在体内外代表肌成纤维细胞分化及增殖程度的主要调节因素^[13]。吴丹等^[14]采用含不同浓度6-O-羧甲基壳聚糖(0，100，200，400 mg/L)的DMEM培养液分别培养肌成纤维细胞，培养24 h后收集细胞培养上清，运用双抗体夹心ELISA法检测各组转化生长因子β1蛋白表达水平，运用荧光定量RT- PCR技术检测各组转化生长因子β1 mRNA表达水平。发现与空白组相比，3个药物剂量组肌成纤维细胞转化生长因子β1蛋白及mRNA的表达均减少(P < 0.05)，药物浓度越高表达量越低(P < 0.05)，且转化生长因子β1蛋白及mRNA表达的变化具有一致性，从而证明了甲壳素能够抑制肌成纤维细胞的增殖和分化，抑制瘢痕收缩。

廖红等^[15]研究壳聚糖对大鼠Ⅲ度烧伤创面表皮生长因子和血小板源性生长因子表达的影响，发现4%壳聚糖组对烧伤后7，14 d创面表皮生长因子的表达、对烧伤后3，7 d创面表皮生长因子mRNA的表达有明显提高，对烧伤后3，7，14 d创面血小板源性生长因子的活性有明显提高，与自然愈合组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，考虑壳聚糖对大鼠Ⅲ度烧伤创面表皮生长因子表达和血小板源性生长因子活性有促进作用。肖海军等^[16]利用不同浓度羧甲基壳聚糖体外培养成纤维细胞4 d后，或经0.1 g/L羧甲基壳聚糖培养不同时间后，采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫法测定其自分泌转化生长因子β1水平，结果发现羧甲基壳聚糖(> 0.1 g/L)可抑制成纤维细胞自分泌转化生长因子β1，且随浓度的增大及作用时间的延长而增强(P < 0.05)，此结果与吴丹等^[14]研究结果相似。

2.2 甲壳素及其衍生物对免疫细胞的影响 王爱丽等^[17]体外培养皮肤和瘢痕成纤维细胞，应用免疫组化及RT-PCR方法测定一氧化氮合酶在瘢痕与正常皮肤组织及细胞中的表达，结果提示一氧化氮合酶表达降低可能是瘢痕增生的机制之一。Jeong等^[18]研究证实高分子量壳聚糖能够单独刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO，但是水溶性壳聚糖(相对分子质量30 000)必须联合干扰素-γ才能刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO。Wu等^[19]研究还发现低分子量壳聚糖(相对分子质量20 000)即使联合干扰素γ也不能刺激巨噬细胞RAW264.7释放NO，而壳寡糖(相对分子质量 2 000)联合干扰素γ能够起到刺激NO用，表明壳聚糖能刺激巨噬细胞释放NO与其分子量大小密切相关。在既往的实验中观察到，与正常皮肤比较，核因子κB在瘢痕疙瘩组织中表现为静息状态持续活化，表明其促进下游靶基因转录、翻译的能力增强^[20]。Chen等^[21]用水溶性壳聚糖(相对分子质量21 000-92 000)处理从人气管炎症处分离的激活巨噬细胞，通过电泳迁移率实验(EMSA)证实壳聚糖能明显抑制激活巨噬细胞核因子kB的核转位，上调抗炎症细胞因子(白细胞介素12)的表达，并能明显改善巨噬细胞对气管上皮的浸润，表明壳聚糖能够通过抑制核因子kB的核转位调节激活的巨噬细胞。Reese等^[22]指出几丁质能够诱导表达白细胞介素4的天然免疫细胞，如嗜曙红细胞、嗜碱细胞等在组织中的累积，从而在过敏性反应起到防御作用。

柯海萍等^[23]将壳寡糖作用于体外培养的小鼠巨噬细胞，运用RT-PCR和ELISA技术发现壳寡糖能促进白细胞介素基因的转录及翻译。Sharpley等^[24]在研究中发现，壳寡糖能刺激体外培养的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β。有学者在实验中提出壳寡糖能促进巨噬细胞因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素8基因的表达，而这些细胞因子又可以反馈激活巨噬细胞和NK细胞^[25]。Sandra等^[26]研究指出壳聚糖明显抑制了PGE2的过量产生及COX-2蛋白的表达和活性，同时一些促炎症因子如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的形成也被抑制，但却加强了抗炎症因子白细胞介素10的形成，从而促进了伤口的愈合。

2.3 甲壳素及其衍生物对胶原代谢的影响 瘢痕组织中基质成分包括胶原纤维、结构性蛋白及蛋白多糖等，其中胶原纤维是瘢痕组织的主要成分，又以Ⅰ型胶原纤维居多。胶原的合成与降解是一个复杂的动态过程，主要涉及蛋白质的翻译、翻译后的修饰、剪接，在这个过程中，多种生物活性酶如氧化酶、蛋白酶、胶原酶和金属蛋白酶等参与其中^[27]。陈海蓉等^[28]使用羟脯氨酸比色法研究羧甲基壳多糖瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响，发现羧甲基壳多糖在10，50，100，200 mg/L对瘢痕成纤维细胞作用48 h后，能显著抑制该细胞胶原的合成(P < 0.01)。既往研究发现羧甲基壳聚糖对正常成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原的分泌无影响，但可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ型胶原的分泌，从而减少Ⅰ型/Ⅲ型胶原的比例。而在邢新等^[29]以瘢痕疙瘩成纤维细胞为研究对象，正常皮肤成纤维细胞为对照，观察不同含量几丁糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞合成分泌胶原量及其相应Ⅰ型前胶原mRNA量的变化，发现几丁糖作用后各组⁹H-脯氨酸掺入量均逐减少，瘢痕疙瘩组与正常皮肤组的减少率差别显著(P < 0.05)，其相应Ⅰ型前胶原mRNA量显著下降(P < 0.01)。甲壳素能明显降低成纤维细胞中Ⅰ型前胶原mRNA的表达，并且可以抑制成纤维细胞合成分泌Ⅰ型胶原。Okamura等^[30]研究发现几丁糖促进成纤维细胞分泌白细胞介素8及Ⅰ型胶原酶，从而使细胞外基质中胶原的降解加速，彭思凯等使用ELISA检查小鼠瘢痕中MMP-1含量的方法印证了这一结论^[31]。Nieuwdorp等^[32]研究表明，低浓度的肿瘤坏死因子α能够促进成纤维细胞的增生，并刺激其合成胶原及氨基聚糖；同时，低浓度肿瘤坏死因子α还可以刺激上皮成纤维细胞中胶原酶的表达，增强蛋白多糖酶活性，最终引起胶原和氨基多糖降解的速度加快；但大剂量肿瘤坏死因子α则对纤维蛋白的合成产生抑制效应。Nishiyama等^[33]研究指出壳聚糖能够促进巨噬细胞RAW264.7内MAPK(p38、Erk1/2、JNK)磷酸化，进而促进TH1型细胞因子(白细胞介素12、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α)大量分泌，从而可以推测甲壳素能通过促进肿瘤坏死因子α来抑制胶原的合成。

甲壳素还能增加Ⅳ型胶原和弹性胶原的分泌。Minami等^[34]研究发现，将聚酯纤维和甲壳素混合物加入小牛屈肌腱中培养，3周后加入甲壳素的肌腱中Ⅰ型胶原蛋白含量较对照组显著减少，同时Ⅳ型胶原和弹性胶原的分泌显著增加，加入甲壳素的肌腱张力是未加入甲壳素的肌腱张力的2倍。

2.4 甲壳素及其衍生物对肉芽血液循环的影响 瘢痕处于缺血、缺氧状态，这种环境可选择性地使胶原合成能力强的成纤维细胞增生，使其在病变组织中占主导地位，最终导致大量胶原纤维沉积。缺氧可选择同源性成纤维细胞群体，它们产生胶原的速度显著大于异源性成纤维细胞群体。缺氧还能导致细胞内线粒体呼吸链中的电子载体泛醒发生非酶性氧化产生自由基。自由基可以消除胶原合成限速因子轻化酶的影响，而使原胶原蛋白迅速转化为胶原蛋白，从而增加胶原合成。有研究发现，壳聚糖通过刺激多种细胞的生长诱导血管再生和肉芽生成，这些细胞包括成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和分叶核细胞^[35]。刘宗军等^[36]观察动脉内皮细胞在壳聚糖和磷脂化壳聚糖作用下的增殖和迁移情况，发现内皮细胞在聚糖和磷脂化壳聚糖膜上的增殖率分别达88.8%和77.8%，存活内皮细胞数目较不锈钢片组显著增加(P < 0.01)；聚糖和磷脂化壳聚糖膜的细胞迁移数目较空白组显著增加(P < 0.01)，能促进内皮细胞的增殖和迁移。许庆等^[37]研究壳聚糖单体对内皮细胞血管化功能的影响时，发现壳聚糖单体能突增内皮细胞在胶原表面形成管状结构的生成率，促进内皮细胞血管化功能。Minami等^[34]研究发现加入甲壳素的聚酯纤维在小牛屈肌腱培养3周后，甲壳素组新生血管数量和强度显著高于非甲壳素组。由此推断，由于毛细血管数量增加，使得创面局部的血供增加，含氧量增加，氧含量的增加使得局部水肿及过氧反应减轻，利于组织修复。

2.5 甲壳素及其衍生物对表皮细胞的影响 创伤后创面的早期愈合是减少感染和瘢痕增生的重要因素。Cho等^[38]研究发现水溶性甲壳素可以加快伤口愈合速度，他们在大鼠身上制造背部皮肤全层损伤模型，然后将水溶性甲壳素、壳聚糖、甲壳素分别置于创面上，7 d后，水溶性甲壳素所覆盖伤口已完全愈合，其胶原排列也和正常组织接近，强度较甲壳素和壳聚糖组高。

2.6 甲壳素及其衍生物对细菌的抑制作用 创面感染是瘢痕增生的重要原因。创面感染的主要细菌为金黄色葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌等，这些细菌均带有负电荷。甲壳素由于其天然属性，带有很强的正电荷，壳聚糖的抗菌谱广，抗菌作用强，对细菌和真菌均有抑制作用^[39]。甲壳素可以通过自身所带的正电荷与微生物细胞膜所携带的负电荷相互作用^[40]，破坏细菌细胞壁原有结构，造成细胞成分的泄漏而起到抗菌作用；另一机制是小分子壳聚糖通过渗透进入细胞内，与带有阴离子的生物大分子发生类似“絮聚”的作用，扰乱细胞的正常生理功能，从而抑制细菌的繁殖和生长。临床对多重耐药铜绿假单胞茵感染的治疗较为棘手。陈慧萍^[41]用甲壳素替代药物作稀释法药敏试验，检测甲壳素对多重耐药铜绿假单胞茵的体外最低押茵药物浓度。结果测得最低抑菌浓度(MiC)值在8-128 mg/L范围之间，显示甲壳素对其具有良好的抑茵活性。另外医用甲壳素抗菌辅料也已应用于临床，取得了很好效果。

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引言

瘢痕是皮肤创伤修复和愈合过程的产物^[1]。除表浅的伤口可以通过简单上皮形成修复外，任何深达真皮和皮下组织的损伤，都会通过瘢痕形成来修复。过度的瘢痕增生又称为瘢痕疙瘩、蟹足肿，临床上有与增生性瘢痕类似的组织学特征和病理学特征，因此，人们常常把增生性瘢痕和瘢痕疙瘩合并进行研究。关于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的产生机制，已经进行了一个多世纪的研究。随着研究的深入，瘢痕的产生过程已被越来越清晰的揭示出来。

目前认为，组织损伤后的修复分为分为3个阶段：第1阶段是细胞体液阶段，在此阶段由于各种激活剂产物、炎性递质和溶酶体酶等损伤因子的释放，导致多形核细胞和巨噬细胞等细胞间活性的增强，并开始出现胶原沉积。肉芽组织在此阶段形成，伴有淋巴细胞，中性粒细胞等炎症细胞的浸润；第2阶段是氨基多糖和胶原的沉积聚合阶段，此阶段胶原的沉积造成最终的粘连，除间质细胞外，成纤维细胞是胶原的主要来源。沉积的胶原分子通过弱的凝聚力结合为大的纤维蛋白原复合物，再通过交联共价稳定；第3阶段是瘢痕重塑阶段，在此阶段胶原进一步致密，成纤维母细胞消失，成纤维细胞取而代之。

在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩病例中，成纤维细胞表达的胶原蛋白代谢功能失去正常的调控，合成能力增强，而降解能力降低，引起胶原纤维蛋白过度沉积，同时细胞外基质表达量也增加，导致伤口肉芽组织过度增生，肉芽组织逐渐发生纤维化^[2]。在此过程中，成纤维细胞、表皮细胞、炎症细胞、细胞外基质及一系列相关细胞因子的作用起到了关键作用。同时，炎症、感染、张力对合等因素也在瘢痕增生中起到了重要作用。以修复过程来看，在瘢痕形成早期干预胶原分泌、沉积、交联，瘢痕形成晚期抑制成纤维细胞数量，都有可能对瘢痕增生起到抑制作用。

近年来国内外很多学者运用成纤维细胞培养技术，在体外控制条件下研究瘢痕组织来源成纤维细胞的生长增殖、胶原合成、形态结构及其影响调控因素，对于瘢痕形成的机制已有一定的了解。

甲壳素，又名甲壳质、几丁质等，是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以13-1，4糖苷键形式连接而成的天然多糖，广泛存在于低等动物，特别是节肢动物如昆虫、甲壳动物等的外壳及低等植物菌藻类的细胞壁中，是一种天然的生物高分子。在自然界的产量仅次于纤维素。由于具有良好的组织相容性、生物可降解性、无免疫原性、无生殖毒性、无致敏性、无排异性等，使甲壳素及其衍生物在食品、美容、纺织、环境保护、农业、生物等领域中有着广泛的应用^[3]。

实验证明甲壳素具有加快伤口愈合能力，对受损伤的生物体能诱生特殊细胞，加快创伤愈合，特别是促进愈合张力的增长作用，对血清中的中分子量物质具有高透过性，对血清蛋白质等血液成分的吸附能力很大，同时具有消炎、止血、镇痛和抑菌等性能。目前国内外多项实验证明甲壳素不仅具有止痛、止血抑菌等药理活性，还能促进伤口愈合、减小瘢痕^[5-6]，通过抑制成纤维细胞、胶原代谢、促进肉芽血液循环等抑制瘢痕的增生。随着人们对瘢痕治疗研究的逐步深入，对美越来越高的追求，甲壳素及其衍生物在抑制瘢痕方面的作用及机制成为了近年来研究的热点。

文章综合了国内外相关文献，整理并归纳了近年来甲壳素的研究进展，通过其对成纤维细胞、炎症细胞、胶原代谢、肉芽血液循环及细胞因子等的不同作用，来阐述甲壳素及其衍生物在抑制瘢痕形成过程中的作用。

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